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Nature Microbiology volume 8, pages 860–874 (2023)Citer cet article

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Les vaccins jouent un rôle essentiel dans la lutte contre la pandémie de COVID-19. Le contrôle futur de la pandémie nécessite des vaccins améliorés avec une efficacité élevée contre les nouvelles variantes du SRAS-CoV-2 et la capacité de réduire la transmission du virus. Ici, nous comparons les réponses immunitaires et l'efficacité préclinique du vaccin à ARNm BNT162b2, du vaccin Ad2-spike à vecteur adénoviral et du candidat vaccin à virus vivant atténué sCPD9 chez les hamsters syriens, en utilisant des schémas de vaccination homogènes et hétérologues. L'efficacité comparative du vaccin a été évaluée en utilisant les lectures des titrages de virus au séquençage d'ARN unicellulaire. Nos résultats montrent que la vaccination contre le sCPD9 a suscité l'immunité la plus robuste, y compris une clairance virale rapide, une réduction des lésions tissulaires, une différenciation rapide des pré-plasmablastes, de fortes réponses humorales systémiques et muqueuses et un rappel rapide des lymphocytes T mémoire du tissu pulmonaire après une provocation avec le SRAS hétérologue. -CoV-2. Dans l'ensemble, nos résultats démontrent que les vaccins vivants atténués offrent des avantages par rapport aux vaccins COVID-19 actuellement disponibles.

En 2023, 13 vaccins COVID-19 répondaient aux normes d'utilisation d'urgence (EUL) de l'OMS1. Les vaccins autorisés comprennent les virus inactivés et les vaccins sous-unitaires, les vaccins à vecteur adénoviral et les vaccins à ARNm modifiés par des nucléosides2. Alors que les vaccins disponibles offrent une protection durable contre les maladies graves, la diminution de l'immunité est évidente, en particulier suite à l'émergence et à la propagation des variantes d'omicron3,4.

Les vaccins COVID-19 optimaux protègent contre les maladies graves, couvrent un large éventail de variantes virales et préviennent ou limitent la transmission du SRAS-CoV-2. Les vaccins vivants atténués (VLA), qui ont été utilisés avec succès contre des infections virales telles que la rougeole, les oreillons et la rubéole (ROR)5, offrent des avantages par rapport aux autres types de vaccins. Ils ne nécessitent pas d'adjuvants6 et peuvent être administrés localement, par exemple par voie intranasale, comme dans le cas des VLA grippe7. Composés de virus capables de se répliquer, les LAV intranasaux imitent le cours naturel de l'infection et de la production d'antigènes, ce qui les distingue des vaccins à base de vecteur ou d'antigène administrés localement et incompétents pour la réplication8. Contrairement aux vaccins générés empiriquement utilisés dans le passé, la conception moderne des LAV utilise des outils moléculaires pour limiter la réplication et la virulence du virus tout en maintenant l'immunogénicité et l'intégrité antigénique9. Une stratégie récente employée dans la conception rationnelle des LAV est la désoptimisation des paires de codons (CPD), qui convient à la fois aux virus à ADN10 et à ARN11, y compris le SRAS-CoV-212.

Les vaccins COVID-19 actuels sont administrés par voie intramusculaire et induisent efficacement une immunité systémique, y compris un titre élevé d'anticorps neutralisants, des lymphocytes T mémoire centraux et effecteurs13, des lymphocytes T CD8+ résidant dans le nez14, des lymphocytes B du centre germinal15 et des plasmocytes à longue durée de vie16. Cependant, cette voie est moins efficace pour induire des réponses IgA et IgG muqueuses durables17,18 et des réponses de cellules mémoires résidentes dans les tissus pulmonaires19. Les anticorps muqueux au site d'entrée du virus jouent un rôle crucial dans la limitation de l'infectiosité et de la transmission20. En conséquence, les cellules mémoire résidant dans les tissus subissent des réponses de rappel plus rapides en raison du positionnement local et permettent une reconnaissance plus précoce des antigènes apparentés21. Par conséquent, les vaccins administrés par voie respiratoire devraient fournir une immunité muqueuse locale robuste contre les agents pathogènes ciblés22. Ici, nous comparons différents vaccins et régimes vaccinaux, en évaluant l'immunité systémique et muqueuse conférée par chaque vaccin.

Dans un contexte de défi SARS-CoV-2 Delta hétérologue, nous avons évalué l'efficacité et le mode d'action du vaccin commercial à ARNm BNT162b2 et de deux vaccins candidats, Ad2-Spike, un vecteur adénoviral portant la glycoprotéine de pointe du SARS-CoV-223 et un vaccin vivant -SARS-CoV-2 atténué nommé sCPD924,25. Pour évaluer l'efficacité, des hamsters syriens ont été vaccinés avec une dose unique (régime d'amorçage uniquement) et provoqués avec la variante SARS-CoV-2 Delta 21 jours après la vaccination. Un autre groupe de hamsters a reçu deux doses de vaccin à 21 jours d'intervalle (régime d'amorçage-rappel) et a été infecté par provocation 14 jours après le rappel (Fig. 1a). Toutes les vaccinations ont été bien tolérées, comme en témoignent les gains de poids constants après la vaccination (Extended Data Fig. 1a).

a, schéma expérimental. Des hamsters syriens ont été vaccinés comme indiqué et provoqués avec le SARS-CoV-2 (1 × 105 pfu SARS-CoV-2 Delta). Les expériences d'amorçage et d'amorçage ont été réalisées indépendamment. b, les poids corporels (en %) après la provocation par le virus ont été mesurés jusqu'au moment de l'analyse et affichés en fonction du groupe de vaccination. Diagramme de violon (tronqué) avec quartiles et médiane. c–l, Résultats des animaux vaccinés par primo-vaccination et provoqués (c–e,i,j) et résultats des animaux vaccinés par primo-vaccination et provoqués (f–h,k,l) : nombre de copies d'ARN génomique (ARNg) détecté dans des écouvillons oropharyngés (c,f) et du tissu pulmonaire homogénéisé (d,g). e, h, Quantification du virus compétent pour la réplication en pfu par 50 mg de tissu pulmonaire homogénéisé. La ligne pointillée marque la limite de détection (DL = 5 pfu). Titre inférieur aux limites de détection fixées à DL/2 = 2,5 pfu i,k, L'inflammation pulmonaire a été notée incluant la sévérité de la pneumonie, la nécrose épithéliale alvéolaire et l'endothélialite. j,l, Score d'œdème pulmonaire prenant en compte l'œdème périvasculaire et alvéolaire. m, les coupes pulmonaires gauches colorées par H&E illustrent différentes sévérités de pneumonie, y compris les manchettes péribronchiques et les zones consolidées entre différents calendriers de vaccination et les animaux non vaccinés à 5 dpc. Barre d'échelle, 3 mm. Dans les diagrammes à points de dispersion c–e et f–h : les lignes indiquent les moyennes, les symboles représentent les hamsters individuels. Dans i,j,k,l : les lignes centrales représentent les médianes, les cases les 25e au 75e centiles et les moustaches les valeurs minimales à maximales ; les symboles représentent des hamsters individuels. En c–l, l'analyse de variance à deux voies (ANOVA) et le test de comparaisons multiples de Tukey sont présentés. n = 5 animaux par groupe. *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001 et ****P < 0,0001. La figure 1a a été créée avec BioRender.com.

Données source

Toutes les stratégies de vaccination ont protégé les hamsters de la perte de poids corporel induite par l'infection par le SRAS-CoV-2 (Fig. 1b). Après une seule vaccination, aucun des vaccins n'a complètement empêché l'infection par le SRAS-CoV-2 Delta, comme en témoigne la présence d'ARN viral dans les voies respiratoires (Fig. 1c, d). Seul le vaccin sCPD9 a efficacement réduit la réplication du virus à des niveaux indétectables 2 jours après la provocation (dpc) (Fig. 1e). La vaccination prime-boost a amélioré l'efficacité globale du vaccin contre le SRAS-CoV-2 (Fig. 1f, g). Après la vaccination de rappel, l'ARN viral a été significativement réduit, mais toujours détectable dans tous les groupes dans les écouvillons oropharyngés et les poumons. Les schémas de vaccination utilisant sCPD9 étaient supérieurs pour réduire l'ARN viral (Fig. 1f, g). De même, les niveaux de virus compétents pour la réplication dans les poumons ont été significativement réduits chez les animaux vaccinés à 2 dpc. Il est important de noter que seule la vaccination de rappel sCPD9 a réduit les niveaux de virus répliquant en dessous du seuil de détection, quel que soit l'amorçage hétérologue (ARNm) ou homologue (sCPD9) (Fig. 1h). Les résultats ont été confirmés par le séquençage de l'ARN en vrac des poumons (Extended Data Fig. 1b).

Pour déterminer les lésions pulmonaires induites par l'infection, les hamsters provoqués ont été examinés par histopathologie. Après une vaccination unique, le sCPD9 était le plus efficace pour prévenir l'inflammation et la pneumonie, comme en témoignent les zones pulmonaires moins consolidées (Fig. 1m) et les scores inférieurs pour l'inflammation pulmonaire, la bronchite et l'œdème (Fig. 1i, j et Données étendues Fig. 1c – f ). Notamment, les animaux ayant reçu d'autres schémas de vaccination présentaient une hyperplasie bronchique plus importante (Extended Data Fig. 2). Une tendance similaire a été observée pour les régimes prime-boost ; cependant, le vaccin à ARNm en particulier a présenté un résultat histologique amélioré résultant d'un rappel homologue (Fig. 1k, l et Extended Data Fig. 1g – j). Dans l'ensemble, la vaccination de rappel sCPD9 homologue a fourni une protection pulmonaire supérieure contre l'inflammation (Figs. 1m et 2a, et données étendues Fig. 2). L'analyse du transcriptome pulmonaire a également montré une large régulation à la baisse des gènes liés à l'infection et à l'inflammation chez les hamsters vaccinés, les effets les plus importants étant observés dans les vaccinations sCDP9 homologues et hétérologues (Fig. 1 supplémentaire).

a, des coupes pulmonaires colorées à l'H&E à 5 jours par jour de l'expérience de vaccination primaire ont identifié des lymphocytes périvasculaires (1), un œdème périvasculaire (2), un remodelage épithélial métaplasique (3), une endothélialite (4) et un œdème alvéolaire (5) comme étiqueté par flèches numérotées, groupes comme indiqué. Barre d'échelle, 90 µm. b, projections bidimensionnelles de transcriptomes unicellulaires à l'aide d'une projection d'approximation multiple uniforme (UMAP) de cellules pulmonaires (expérience prime-boost). Les cellules sont colorées par type de cellule annotées sur la base de gènes marqueurs connus. c, d, comptage manuel des cellules pulmonaires isolées par lobe pulmonaire (cellules ct), nombre calculé de types de cellules indiqués (PMN, macrophages monocytaires) sur la base des fréquences cellulaires déterminées par scRNA-seq pour l'expérience prime-boost (c) et première expérience (d). Diagrammes à barres avec moyenne ± sem, les symboles représentent les hamsters individuels (nsCPD9 = 4, nmRNA = 4, nAd2 = 4, nmock = 4, nsCPD9+sCPD9 = 3, nmRNA+sCPD9 = 3, nmRNA+mRNA = 3, nAd2+Ad2 = 3, nmock+mock = 4), ANOVA unidirectionnelle ordinaire et test de comparaisons multiples de Tukey, **P < 0,01. e, Dot plots montrant les changements de pli de l'expression génique dans les types de cellules indiqués des quatre stratégies de vaccination prime-boost par rapport aux animaux vaccinés par simulation. Les gènes sélectionnés stimulés par l'interféron et les cytokines pro-inflammatoires sont visualisés comme suit : la coloration et la taille des points indiquent les changements de pli transformés en log2 (FC) et les valeurs P, respectivement, chez les animaux vaccinés par rapport aux animaux vaccinés fictifs. Les valeurs P ajustées (Padj) ont été calculées par DEseq2 en utilisant les corrections Benjamini-Hochberg des valeurs P bilatérales du test de Wald. Les gènes sont ordonnés par regroupement non supervisé. f, Localisation d'ARN viral par hybridation in situ dans une coupe longitudinale d'une bronche à 2 dpc. Signaux rouges, ARN viral ; bleu, contre-coloration hémalienne. Barre d'échelle, 30 µm.

Données source

Pour corréler les niveaux d'inflammation avec les réponses cellulaires, nous avons effectué un séquençage d'ARN unicellulaire (scRNA-seq) d'échantillons pulmonaires (Fig. 2b et Fig. 2a supplémentaire). Les résultats ont montré que le recrutement pulmonaire des macrophages monocytaires était significativement réduit chez les animaux vaccinés avec sCPD9 + sCPD9 à 2 jpc (Fig. 2c et Supplémentaire Fig. 2b). Des effets similaires, bien que moins prononcés, ont été observés chez les animaux ayant reçu la vaccination primaire sCPD9 uniquement (Fig. 2d et Fig. 2c supplémentaire). De plus, les gènes stimulés par l'interféron induits par l'infection par le SRAS-CoV-226 étaient largement régulés à la baisse chez les animaux vaccinés par rapport aux animaux non vaccinés, les macrophages monocytaires, les monocytes Treml4 + et les cellules endothéliales apparaissant particulièrement réactifs (Fig. 3 supplémentaire). Les médiateurs inflammatoires tels que Cxcl10 ou Tnfsf10 ont montré un schéma de réponse plus uniforme entre les types de cellules par rapport aux gènes stimulés par l'interféron (Fig. 2e et Fig. 4a supplémentaire). Étant donné que les sous-types de macrophages présentaient des modèles d'expression génique différents entre les groupes de vaccination, nous avons examiné la distribution de l'ARN viral dans les poumons par hybridation in situ (Fig. 2f et Fig. 4b supplémentaire). Chez les animaux non vaccinés, l'ARN viral a été détecté dans tous les poumons, tandis que la vaccination ARNm + ARNm a réduit son apparition à des patchs uniques. Chez les animaux sCPD9 + sCPD9, l'ARN viral était à peine détectable (Fig. 4b supplémentaire). Notamment, chez les animaux ARNm + ARNm, la plupart de l'ARN viral détectable était présent dans les macrophages (Fig. 2f).

Pour déterminer les réponses humorales, nous avons quantifié la capacité des sérums de hamster collectés avant la provocation (0 dpc) et à 2 et 5 dpc de prime (Fig. 3a – d) et prime-boost (Fig. 3e – h) des hamsters vaccinés à neutraliser le SRAS. -Variantes du CoV-2. La capacité des sérums des vaccinés sCPD9 à neutraliser la variante ancestrale B.1 du SRAS-CoV-2 dépassait de manière significative celle de tous les autres groupes (Fig. 3a). De même, les sérums sCPD9 ont fourni une neutralisation supérieure des variantes préoccupantes B.1.351 (Beta), B.1.617.2 (Delta) et B.1.1.529 (Omicron, BA.1) (Fig. 3b, c). Pour Omicron BA.1, la capacité de neutralisation a été considérablement réduite dans tous les groupes ; cependant, la neutralisation par les sérums sCPD9 était significative (Fig. 3d). En général, l'infection de provocation a augmenté les anticorps neutralisants au fil du temps dans tous les groupes de 5 jpc (Fig. 3a – d).

a–h, Titres de neutralisation sérique des hamsters qui ont reçu la vaccination prime (a–d) et prime-boost (e–h) avant (0 dpc) et à 2 ou 5 dpc avec le SARS-CoV-2. La capacité de neutralisation a été testée contre la variante B1 (a,e), Beta (b,f), Delta (c,g) et Omicron BA.1 (d,h). La limite inférieure de détection était à la dilution 1:8 (ligne pointillée) et la limite supérieure à 1:2,048. Graphiques à barres avec moyenne ± sem, n = 5 par condition ; en e–h, n = 10 au départ (0 dpc), sauf en e et g où nsCPD9+sCPD9 (0dpc) = 9 et en h où nsCPD9+sCPD9 (0dpc) = 6, nmRNA+sCPD9 (0dpc) = 9 , nmRNA+mRNA (0dpc) = 8, nAd2+Ad2(0dpc) = 8 et nmock+mock (0dpc) = 7 en raison de quantités de sérum limitées. i, niveaux d'IgG spécifiques du SRAS contre le pic, l'ORF3a et la protéine de la nucléocapside dans les sérums de hamsters vaccinés par rappel aux jours 0 et 2 après la provocation. Les résultats sont présentés sous forme de densité optique (DO) déterminée à 450 nm. Ligne médiane, médiane ; encadré, 25e au 75e centiles ; moustaches, minimum à maximum; les symboles indiquent les valeurs individuelles, nsCPD9+sCPD9 (jour 0) = 6, nmRNA+sCPD9 (jour 0) = 6, nmRNA+mRNA (jour 0) = 7, nAd2+Ad2 (jour 0) = 8, nmock+mock (jour 0) = 5, nsCPD9+sCPD9 (jour 2) = 5, nmRNA+sCPD9 (jour 2) = 5, nmRNA+mRNA (jour 2) = 5, nAd2+Ad2 (jour 2) = 5 et nmock+mock (jour 2) = 5 animaux. Pour a–i, les tests de comparaisons multiples de Kruskal-Wallis et Dunn ont été effectués ; *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001 et ****P < 0,0001.

Données source

Les hamsters boostés avec sCPD9 ou le vaccin à ARNm ont produit sensiblement plus d'anticorps neutralisants que ceux recevant la vaccination primaire uniquement. Dans l'ensemble, la vaccination de rappel a augmenté la capacité de neutralisation du sérum dans différentes variantes (Fig. 3e – h). Parmi les variantes testées, Omicron BA.1 a montré la plus grande capacité à échapper à la neutralisation. Seule la vaccination de rappel avec sCPD9 a fourni aux hamsters une capacité significative à neutraliser Omicron BA.1 (Fig. 3h).

Les hamsters vaccinés avec sCDP9 et ARNm + sCDP9 avec prime-boost ont produit des réponses d'anticorps IgG significatives contre la protéine de pointe, l'ORF3a et la protéine de nucléocapside (N), tandis que les IgG provenant de l'ARNm avec prime-boost et des hamsters vaccinés avec Ad2 ne réagissaient qu'avec la protéine de pointe (Fig. 3i). Bien qu'il soit peu probable que les anticorps dirigés contre N et ORF3a contribuent à la neutralisation du virus, l'abondance de ces anticorps illustre la réponse immunologique plus large induite par la vaccination LAV. Un titre de neutralisation du virus plus élevé chez les animaux ayant subi une vaccination de rappel (comparer les Fig. 3a – d avec e – h) ainsi qu'une augmentation de la réactivité anti-pic d'IgG suite à une infection de provocation de ces animaux (Fig. 4c supplémentaire) suggèrent un avantage de vaccinations de rappel.

Ensuite, nous avons évalué les réponses immunitaires unicellulaires du sang à la vaccination de rappel (Extended Data Fig. 3a). La numération des cellules sanguines a identifié des densités cellulaires significativement plus élevées dans les groupes de rappel vaccinés avec sCPD9 et Ad2 (Fig. 4a). Les nombres de cellules relatifs et absolus ont révélé des différences substantielles entre les stratégies de vaccination (Fig. 4b et Extended Data Fig. 3b – d). Les fréquences de neutrophiles matures et immatures (imPMN), qui sont augmentées en particulier dans les cas graves de COVID-1927 et chez les hamsters syriens infectés par le SRAS-CoV-226, étaient les plus faibles pour les animaux vaccinés avec sCPD9 + sCPD9 (Fig. 4b). En revanche, les cellules B, T et plasma ont suivi la tendance opposée et ont affiché les abondances les plus élevées après le régime sCPD9 + sCPD9 (Fig. 4b et Extended Data Fig. 3b). Conformément à nos observations dans les poumons, les gènes liés à l'infection et à l'inflammation étaient largement régulés à la baisse dans les cellules myéloïdes des animaux vaccinés (Fig. 4c et Fig. 5 supplémentaire).

a – e, Analyse de la composition cellulaire et de l'expression génique par scRNA-seq à 2 dpc dans le sang de hamsters vaccinés par prime-boost. a, Numération manuelle des cellules par ml de sang. b, Fréquences des types de cellules indiqués parmi les cellules sanguines. Les lignes pointillées marquent les niveaux moyens trouvés chez les hamsters naïfs (n = 3, données sur les hamsters naïfs dérivées et retraitées de la réf. 26). Diagrammes à barres avec moyenne ± sem, n = 3. Une analyse de variance unidirectionnelle et un test de comparaisons multiples de Tukey ont été effectués. c, diagrammes de points montrant les changements de pli de l'expression génique dans les types de cellules indiqués des quatre stratégies de vaccination de rappel par rapport aux animaux vaccinés par simulation. Les gènes sélectionnés stimulés par l'interféron et les cytokines pro-inflammatoires sont visualisés comme suit : la coloration et la taille des points indiquent les valeurs FC et P transformées en log2, respectivement, chez les animaux vaccinés par rapport aux animaux vaccinés fictifs. Les padj ont été calculés par DEseq2 en utilisant les corrections de Benjamini – Hochberg des valeurs P du test Wald bilatéral. Les gènes sont ordonnés par regroupement non supervisé. d, Dot plots montrant l'expression de gènes marqueurs de développement de cellules B sélectionnés dans les sous-groupes de cellules B sanguines illustrés à la Fig. 9a supplémentaire. La taille du point représente la fraction de cellules dans lesquelles au moins un identifiant moléculaire unique (UMI) du gène respectif a été détecté, tandis que la couleur est proportionnelle à l'expression moyenne dans ces cellules. e, Fréquences et nombre de pré-plasmablastes (pré-PB) identifiés dans le groupe de cellules B 3 et mémoire aux cellules en transition pré-plasmablastes (mem-> pré-PB) identifiées dans le groupe de cellules B 6. Diagrammes à barres avec moyenne ± sem, n = 3. ANOVA unidirectionnelle et tests de comparaisons multiples de Tukey ont été effectués ; *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001, ****P < 0,0001.

Données source

Pour étudier l'activation de la mémoire immunitaire induite par le vaccin, nous avons d'abord examiné les transcriptomes unicellulaires des cellules B circulantes, en nous concentrant sur les cellules B et plasmatiques de hamsters vaccinés avec un rappel. Le sous-clustering a donné 8 populations (Fig. 6a supplémentaire), qui ont été attribuées à des états cellulaires sur la base de gènes marqueurs connus28,29. Il convient de noter qu'en l'absence d'informations sur les marqueurs de surface, ces affectations restent probablement incomplètes. Dans notre analyse, nous nous sommes donc concentrés sur les différences dans les modèles d'expression génique et avons cherché à savoir si une "signature d'expression génique de rappel de mémoire" putative afficherait des différences. Nous avons d'abord déterminé que le groupe 8 représentait probablement des plasmablastes/cellules plasmatiques en raison de la présence, par exemple, de Prdm1 (qui code Blimp-1) ou Irf4. Le groupe 3 comportait des niveaux intermédiaires de Prdm1, ainsi que Tnfrsf17 et Tnfrsf13b. Le groupe 6 en comparaison a montré des niveaux plus élevés de Pax5, Cd19, Cd27, Bach2 ou Aicda et des niveaux inférieurs de Prdm1, Xbp1 ou Spib (Fig. 6b supplémentaire). Sur la base de ces modèles, nous avons supposé que ces deux groupes contiendraient des (pré-) plasmablastes et seraient donc les plus intéressants pour étudier le rappel de la mémoire. En sondant un ensemble de gènes impliqués dans la régulation des cellules B, nous avons trouvé une régulation positive de Irf4, Pax5 et Tnfrsf13b/c dans le groupe 3, tandis que dans le groupe 6, Bach2, Irf4, Pax5 et Tnfrsf13b/c étaient régulés positivement et Aicda, Batf et Cd27 étaient régulé à la baisse (Fig. 4d et Supplémentaire Fig. 6c). Cette «signature d'expression génique de rappel de mémoire» précoce potentielle était la plus forte lors d'une vaccination de rappel homologue ou hétérologue avec sCPD9, qui induisait le titre d'anticorps le plus élevé (Fig. 3e – h). Conformément à cela, les cellules des groupes 3 et 6 étaient significativement plus abondantes chez les hamsters vaccinés avec sCPD9 + sCPD9 (Fig. 4e).

Pour étudier l'occurrence du rappel de la mémoire des lymphocytes T, nous avons procédé au sous-groupement des cellules T et des cellules tueuses naturelles (NK). À cette fin, nous avons dosé les cellules CD4 +, CD8 + et T proliférantes dans le sang (Fig. 5a, b et Fig. 7 et 8 supplémentaires). Les analyses de l'expression génique indiquant la prolifération (Mki67, Top2a), l'état de la mémoire naïve ou centrale (Sell, Ccr7, Lef1, Il7r) et l'activation des lymphocytes T (Cd69, Cd44, Klrg1, Icos, Cd40lg) ont révélé que la plupart des lymphocytes T sanguins présentaient phénotypes de mémoire naïf ou central (groupe 0–4, Fig. 7b – e supplémentaire). À 2 jpc, les gènes effecteurs de l'immunité de type 1 (Tbx21, Gzma, Gzmb, Faslg, Ifn) n'étaient exprimés que par les cellules NK sanguines (cluster 5, Fig. 8 supplémentaire). La population de lymphocytes T en prolifération était constituée de lymphocytes T activés exprimant des marqueurs de mémoire, tels que Il7r (cluster 6, Fig. 8 supplémentaire). Les cellules T proliférantes, bien que généralement en petit nombre, ont augmenté de manière significative après la vaccination hétérologue (Fig. 5b). Dans cette optique, la fraction de cellules et le niveau d'expression des gènes associés à la prolifération étaient les plus élevés lorsque sCPD9 était inclus dans le schéma de vaccination (Fig. 5c). Pour déterminer la spécificité de l'antigène des lymphocytes T, nous avons vacciné des hamsters avec sCDP9 ou ARNm et stimulé leurs splénocytes 14 jours plus tard avec la protéine S ou N recombinante du SRAS-CoV-2. Le spot immuno-enzymatique d'interféron gamma (IFN-γ) (ELISpot) a servi de lecture. La stimulation de la protéine de pointe a induit des cellules sécrétant de l'IFN-γ pour les deux vaccins, alors que lors de la stimulation avec la protéine N, seuls les splénocytes des vaccins sCPD9 ont sécrété significativement plus d'IFN-γ par rapport à la maquette, révélant une immunité supérieure et plus large des lymphocytes T lors de la vaccination LAV (Fig. 5d ).

a–k, sous-ensembles de lymphocytes T par scRNA-seq (2 dpc) de hamsters vaccinés par prime-boost. Fréquences et nombres (a) de lymphocytes T CD4 (groupe 0,1,2) et CD8 (groupe 3,4) et (b) de lymphocytes T proliférants (groupe 6) dans le sang. Graphique à barres avec moyenne ± sem, n = 3 pour tous les groupes, sauf nmock+mock = 4. ANOVA unidirectionnelle ordinaire et test de comparaisons multiples de Tukey. c, Dot plots montrant l'expression de gènes sélectionnés dans le groupe sanguin 6 (analyse des sous-groupes T et NK dans la Fig. 7a supplémentaire). La taille des points représente la fraction de cellules avec UMI> 1, la couleur indique l'expression. d, analyse IFN-γ ELISpot 14 jours après la primo-vaccination. Graphique à barres avec moyenne ± sem, n = 6, affichant le nombre de points normalisé à une stimulation moyenne pour chaque animal, individuellement. Ligne pointillée, limite supérieure de détection (ULD). ANOVA bidirectionnelle et test de comparaisons multiples de Tukey. e–g, Fréquences et nombres de (e) cellules T mémoire résidant dans les tissus (Trm, groupe 6), (f) cellules T activées (Act T, groupe 2) et (g) cellules T proliférantes (cellules T prolif, groupe 5 + 8) dans les poumons. ANOVA unidirectionnelle ordinaire et test de comparaisons multiples de Tukey. Graphique à barres avec moyenne ± sem, n = 3 pour tous les groupes, sauf nmock+mock = 4. Dans a,b,d–g : *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001, ** **P < 0,0001. h, Dot plots montrant l'expression de gènes sélectionnés dans les poumons, groupes 5 et 8 (analyse des sous-groupes T et NK dans la Fig. 9a supplémentaire). La taille des points représente la fraction de cellules avec UMI> 1, la couleur indique l'expression. i, j, score de signature de l'ensemble de gènes Trm (réfs. 28,31) dans les cellules de sous-groupes de cellules T sélectionnés sur tous les groupes (i) et pour les groupes individuels (j), la couleur indique le score de signature pour l'ensemble de gènes Trm. k, score de signature Trm dans les cellules du groupe 5. Centre, médiane ; encadré, 25e au 75e centiles ; et moustaches, valeurs minimales à maximales. Les cercles indiquent les cellules analysées individuelles dans le groupe 5 regroupées à partir de n = 3 pour tous les groupes, sauf nmock + mock = 4 animaux. moi, PAGA. Les nœuds représentent les clusters, les bords représentent l'étendue de la connexion du cluster, la taille du nœud correspond au nombre de cellules du cluster et l'épaisseur de la ligne est proportionnelle à la connectivité. m, score de signature Trm (réfs. 28, 31) en fonction du rang de pseudo-temps de diffusion, avec une ligne noire montrant un ajustement polynomial de degré trois.

Données source

Ensuite, nous avons examiné si différentes stratégies de vaccination prime-boost différaient dans leur capacité à réactiver les lymphocytes T mémoire résidant dans les tissus (Trm) dans les poumons30. Pour caractériser les sous-ensembles de cellules T pulmonaires, nous avons regroupé les groupes initiaux de cellules T et NK en 10 sous-groupes (Fig. 9a supplémentaire). Sur la base de l'expression des gènes Nkg7, Cd3e, Cd4 et Cd8a, nous avons attribué les groupes 3, 7 et 9 aux cellules NK, le groupe 4 aux cellules T CD8+, les groupes 0, 1, 2 et 6 aux cellules T CD4+, et les groupes 8 et 5 sous forme de lymphocytes T proliférants (Mki67, Top2a) (Fig. 9b, c supplémentaires). Parmi les groupes de cellules T CD4 +, les cellules du groupe 2 présentaient un phénotype mixte de marqueurs de gènes effecteurs, d'activation et de mémoire (Figs supplémentaires 9b – e et 10a, b), et les cellules des groupes 0 et 1 étaient de type mémoire naïve ou centrale. (Sell, Ccr7, Lef1, Il7r, Tcf7, S1pr1) (Fig. 10a supplémentaire). Dans le groupe 6, nous n'avons pas trouvé de gènes associés à des signatures naïves ou associées à la mémoire centrale (Fig. 10a supplémentaire), mais une expression combinée et forte des gènes de localisation des lymphocytes T et de rétention tissulaire (Cxcr6, Rgs1, Prdm1, Znf683, Itga1 et Itgae), une signature indiquant le statut Trm (Figs. 10b, c et 11 supplémentaires). Les cellules Trm (cluster 6) affichaient un niveau d'expression génique et une fraction cellulaire plus élevés exprimant Cxcr6, un récepteur tissulaire important, dans les groupes vaccinés avec sCPD9, tandis que le récepteur de rétention ganglionnaire S1pr1 était le moins détecté (Fig. 12a supplémentaire). Dans les cellules T activées (groupe 2), l'expression génique des gènes d'activation et effecteurs était indépendante de la vaccination précédente (Fig. 12a supplémentaire). À 2 jpc, les cellules Trm, les populations de cellules T activées et proliférantes étaient petites et représentaient moins de 2 % de toutes les cellules pulmonaires. Les cellules Trm et les cellules T activées avaient tendance à augmenter les fréquences et les nombres chez les vaccinés sCPD9 provoqués, mais seules les cellules T proliférantes affichaient des valeurs significativement plus élevées (Fig. 5e – g). Notamment, contrairement aux lymphocytes T qui prolifèrent dans le sang, leurs homologues pulmonaires exprimaient des niveaux plus élevés d'Ifng et de Gzma (Fig. 5h).

Ensuite, nous avons noté les grappes de Seurat pour un ensemble de gènes Trm humain publié31 et observé un sous-ensemble de cellules dans la grappe 5 (cellules T proliférantes) avec un score de signature Trm élevé (Fig. 5i). À 2 jpc, le score de signature Trm dans les lymphocytes T proliférants (groupe 5) était remarquablement plus élevé chez les vaccinés sCPD9 (Fig. 5j, k). Dans le groupe 8 (cellules T proliférantes), le nombre global de cellules était trop faible pour générer des scores interprétables, et aucune cellule n'a été identifiée chez les animaux non vaccinés (Fig. 12b supplémentaire). En utilisant une approche PAGA (partition-based graph abstraction)32, nous avons identifié une connectivité particulièrement forte entre les clusters 2, 8 et 5, et les clusters 2 et 6, ainsi qu'une éventuelle connexion entre les clusters 6 et 8 (Fig. 5l). Ordonner les cellules en fonction de la similarité d'expression globale par pseudo-temps de diffusion33 et tracer ce rang par rapport à la signature Trm corrobore davantage un chemin entre les clusters 2 et 6, et les clusters 8 et 5, qui s'accompagne d'une expression génique variable de type Trm (Fig. 5m et Supplémentaire Figures 12c,d). Dans l'ensemble, ces résultats suggèrent qu'un sous-ensemble de lymphocytes T en prolifération est dérivé du rappel Trm et activé en réponse à l'infection par le SRAS-CoV-2 chez les hamsters boostés par sCPD9.

En plus de la puissante mémoire des lymphocytes T et de l'immunité humorale, l'induction d'une immunité muqueuse protectrice est une propriété distinctive des LAV administrés aux sites d'entrée du virus34. Pour corréler l'induction de l'immunité muqueuse avec les régimes vaccinaux, nous avons mesuré les niveaux d'IgA spécifiques au pic de SRAS-CoV-2 et la capacité de neutralisation des lavages nasaux. Nous avons constaté que les animaux vaccinés uniquement avec le sCPD9 hébergeaient des quantités considérablement plus importantes d'IgA dans les lavages nasaux avant et après la provocation (Fig. 6a). L'infection de provocation a encore augmenté les niveaux d'anticorps IgA spécifiques à la pointe du SRAS-CoV-2 chez les animaux vaccinés avec le sCPD9 et induit des quantités détectables chez les animaux vaccinés avec l'ARNm et l'Ad2. Les tests de microneutralisation contre le SRAS-CoV-2 (variante B.1) avec des lavages nasaux obtenus à partir d'animaux stimulés ont confirmé les mesures d'IgA. Les vaccinés sCPD9 présentaient des capacités de neutralisation nettement plus élevées à 2 et 5 dpc (Fig. 6b). En conséquence, nous avons identifié des lymphocytes IgA-positifs dans la muqueuse nasale des animaux vaccinés (Fig. 6c). Le score histopathologique a indiqué que les animaux vaccinés avec le sCPD9 présentaient moins de zones tissulaires affectées, moins de dommages et un recrutement réduit des cellules immunitaires (Fig. 6d, e et Extended Data Fig. 4a). La vaccination sCDP9 a réduit de manière significative l'ARN viral dans les lavages nasaux par rapport à la simulation à 2 dpc (Fig. 6f), en corrélation avec un signal réduit dans la coloration immunohistochimique de la protéine N virale (Fig. 6d). Pour évaluer plus en détail les effets potentiellement bénéfiques de l'immunité muqueuse, nous avons eu recours au scRNA-seq des cellules du tissu nasal. Tout d'abord, nous avons annoté les types de cellules sur la base de gènes marqueurs précédemment publiés (Extended Data Fig. 4b35). En particulier dans les cellules neuronales, l'analyse différentielle de l'expression génique a montré que les gènes stimulés par l'interféron (Isg15, Oasl2 ou Rsad2) étaient moins exprimés chez les vaccinés sCPD9 (Fig. 6g et Supplémentaire Fig. 13). Notamment, les réponses de spectateurs des cellules neuronales de l'épithélium olfactif sont liées à la perte d'odorat après une infection par le SRAS-CoV-236. De plus, nous trouvons des preuves que la vaccination par le VLA empêche la transmission du SRAS-CoV-2. Suite à l'infection d'épreuve, les animaux vaccinés au LAV excrétent des quantités de virus significativement inférieures à celles des individus vaccinés à l'ARNm. Dans cette configuration, la vaccination par le LAV a pu empêcher la transmission du SRAS-CoV-2 alors que la vaccination par l'ARNm ne l'a pas été (Extended Data Fig. 5). Pris ensemble, nous apportons la preuve que le sCPD9 LAV offre une protection supérieure contre le SRAS-CoV-2 dans les voies respiratoires inférieures et supérieures, ce qui en fait un candidat prometteur pour une enquête plus approfondie dans les essais cliniques.

a, ELISA détectant les taux d'IgA anti-pointe dans les lavages nasaux de hamsters vaccinés à des moments indiqués après la provocation (dpc). Affichage des résultats OD450. b, capacité de neutralisation contre B.1 des fluides de lavage nasal du hamster vacciné par rappel aux moments indiqués. Les diagrammes à barres montrent la moyenne ± sd Test de comparaisons multiples de Kruskal-Wallis et Dunn par point de temps ; *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001, ****P < 0,0001. Les symboles indiquent les hamsters individuels, n = 5 animaux par groupe. c, coloration immunohistochimique d'IgA dans l'épithélium olfactif et les glandes sous-muqueuses à 2 dpc. Barre d'échelle, 60 µm. d, sections histopathologiques longitudinales de l'épithélium olfactif, avec coloration H&E (à gauche) et immunohistochimie de la protéine SARS-CoV-2 N (à droite) de l'expérience principale uniquement à 2 dpc, avec une section supplémentaire d'un tissu non infecté. e, Comme dans d mais pour l'expérience de vaccination prime-boost. Barre d'échelle, 20 µm. En c–e, les images sont représentatives de n = 5 hamsters par groupe indiqué. Les expériences d'amorçage et d'amorçage ont été réalisées indépendamment. f, Charges d'ARN viral détectées dans les lavages nasaux de hamsters vaccinés à 2 et 5 jpc. Dans les diagrammes à points de dispersion, les lignes indiquent les moyennes, les symboles représentent les hamsters individuels. n = 5. ANOVA bidirectionnelle et test de comparaisons multiples de Tukey ; *P < 0,05. g, Dot plots montrant les changements de pli de l'expression génique dans les types de cellules indiqués des trois stratégies de vaccination primaire par rapport aux animaux vaccinés fictifs. Les gènes sélectionnés stimulés par l'interféron et les cytokines pro-inflammatoires sont visualisés comme suit : la coloration et la taille des points indiquent les valeurs FC et P transformées en log2, respectivement, chez les animaux vaccinés par rapport aux animaux vaccinés factices. Les padj ont été calculés par DEseq2 en utilisant les corrections de Benjamini – Hochberg des valeurs P du test Wald bilatéral. Les gènes sont ordonnés par regroupement non supervisé.

Données source

Les vaccins COVID-19 actuels sont très efficaces pour prévenir les maladies graves ; cependant, l'infection par des variants nouvellement émergents n'est pas prévenue et les charges virales peuvent être élevées chez les personnes vaccinées37. Pour contrôler la transmission du virus et limiter l'infection symptomatique, l'immunité muqueuse au site d'entrée du virus est considérée comme d'une importance primordiale38,39,40.

Nous présentons ici une comparaison de vaccins multiplateformes qui comprend un LAV, qui, selon nous, suscite une protection supérieure contre l'infection par le SRAS-CoV-2, en particulier aux sites muqueux d'entrée du virus. Cela concorde avec les précédentes études précliniques sur le vaccin COVID-19 utilisant l'administration intranasale de LAV, de vaccins à pointes à base de protéines ou à vecteur viral24 et l'induction efficace de l'immunité muqueuse41,42,43,44. Nos observations sur l'amélioration de l'immunité induite par la vaccination de rappel hétérologue sont conformes aux études récentes qui combinent une sensibilisation systémique suivie d'un rappel intranasal avec un vecteur adénoviral ou des vaccins à ARNm19,45. Il est important de noter que les IgA anti-SRAS-CoV-2 neutralisant le virus au niveau de la muqueuse nasale des animaux vaccinés sont beaucoup plus élevées chez les animaux vaccinés avec le sCPD9. Il est bien connu que les IgA muqueuses exercent diverses fonctions, telles que le blocage de l'entrée du virus, la prévention de la fusion intracellulaire du virus et des membranes endosomales ainsi que l'inhibition de la libération de virus à partir des cellules hôtes46. La protection globale contre la réplication du virus, les lésions tissulaires et l'inflammation pulmonaire était significativement meilleure chez les animaux vaccinés avec le sCPD9. Dans le même temps, la reconnaissance de l'antigène était considérablement plus large chez les animaux qui avaient reçu sCPD9, et ces avantages sont probablement le résultat d'importantes caractéristiques distinctives du LAV. Celles-ci comprennent l'administration via la voie naturelle d'infection, la présentation du répertoire antigénique complet du virus et la réplication imitant l'agent pathogène cible. De plus, la réplication active des LAV peut entraîner une présentation prolongée et accrue des antigènes viraux par rapport aux vaccins non réplicatifs, un facteur qui pourrait contribuer à la meilleure efficacité observée ici. Dans une expérience à petite échelle, la vaccination LAV a pu abroger la transmission ultérieure du SRAS-CoV-2, tandis que la vaccination par ARNm n'a eu que des effets mineurs sur la transmission. L'analyse scRNA-seq d'échantillons de sang, de poumons et de muqueuse nasale de hamsters vaccinés et infectés par le SRAS-CoV-2 a révélé que pour tous les paramètres importants, les effets étaient les plus forts pour la vaccination sCPD9 dans un contexte de primo-infection uniquement. De même, dans un contexte de rappel, la double vaccination sCPD9 était supérieure à la vaccination ARNm-sCPD9, suivie de la double vaccination ARNm et de la double vaccination adénovirus. Les animaux vaccinés avec le sCPD9 présentaient une induction considérablement réduite des programmes d'expression de gènes pro-inflammatoires, une caractéristique principale de la pathogenèse du COVID-1947. Cela était particulièrement vrai pour les cellules du système immunitaire inné, telles que les monocytes et les macrophages, qui ont généralement de fortes réponses transcriptionnelles pro-inflammatoires lors de l'absorption du SRAS-CoV-226. S'il est traduisible chez l'homme, cela pourrait signifier un risque beaucoup plus élevé d'évolution bénigne ou asymptomatique de la maladie, même en cas d'infection par des variants hétérologues du SRAS-CoV-2.

De plus, nous avons détecté plusieurs signatures d'expression génique liées à l'activation de la mémoire immunitaire adaptative. Le développement accru vers les pré-plasmablastes dérivés des cellules B mémoire et la prolifération accrue des cellules T dans le sang des animaux provoqués par scRNA-seq indiquent une activation rapide des cellules mémoire48. Nous avons également détecté une augmentation significative du nombre de lymphocytes T en prolifération dans les poumons de hamsters ayant reçu du sCPD9. Un sous-ensemble de ces lymphocytes T proliférants partageait une signature spécifique à Trm et montrait une connectivité au cluster Trm identifié. Une explication possible de cette observation est que l'ensemencement des lymphocytes T mémoire spécifiques au SRAS-CoV-2 est amélioré après la vaccination sCPD9, ce qui peut permettre des réponses de rappel locales plus rapides, caractérisées par une prolifération accrue des lymphocytes T dans les groupes de vaccins correspondants. Les LAV imitent l'infection naturelle, qui est connue pour induire des cellules CD4+ Th1 spécifiques au SARS-CoV-2 sécrétant de l'IFN-γ49. Nous avons détecté une régulation positive de l'IFN-γ dans les lymphocytes T pulmonaires en prolifération, indiquant que la provocation par le SRAS-CoV-2 a déclenché une réponse de type cellule effectrice Th1, et l'analyse ELISpot de l'IFN-γ a révélé une réactivité multi-antigène dans les splénocytes de hamsters vaccinés au LAV. Alors que l'induction d'IgA muqueuses reste la plus importante pour limiter l'infection et donc la transmission, les lymphocytes T CD4+ mémoire des voies respiratoires contribuent à la protection contre d'autres coronavirus30 et améliorent potentiellement le répertoire antigénique reconnu dans un vaccin muqueux contre le SRAS-CoV-2. De même, des études antérieures utilisant des antigènes d'ovalbumine et une combinaison de différentes voies de vaccination ont indiqué que non seulement l'IgA mais aussi l'immunité générale à médiation Th1 sont renforcées lors de l'administration muqueuse50.

Notre analyse de séquençage d'ARN unicellulaire a plusieurs limites. Cette technique, telle qu'elle est employée ici, ne peut pas capturer pleinement des processus tels que la réactivation des cellules mémoire en raison du manque de marqueurs de surface et d'enrichissement spécifique au type de cellule. En raison d'une annotation incomplète du génome du hamster syrien, nous n'avons pas été en mesure d'identifier les cellules IgA-positives. La qualité des données des cellules de la muqueuse nasale était relativement faible en raison de la dissociation difficile du tissu, ce qui a limité nos observations au site de l'infection initiale. Les données que nous présentons sur l'effet de la vaccination sur la transmission du virus de provocation sont préliminaires et nécessitent des études à plus grande échelle, l'utilisation de variants SARS-CoV-2 plus récents et des analyses mécanistes pour la validation. Bien que nos données montrent une supériorité et donc promettent un développement et un raffinement ultérieurs des LAV, il y a une mise en garde pour extrapoler les résultats des essais précliniques sur les animaux à la situation chez l'homme. De toute évidence, les études cliniques concernant l'innocuité et l'efficacité des vaccins vivants atténués sont mandatées pour évaluer de manière réaliste le potentiel de ces vaccins pour lutter contre la pandémie encore en cours.

Un problème avec les LAV est leur sensibilité potentielle à une immunité précédemment établie51, ce qui limiterait la réplication du virus vaccinal et limiterait potentiellement leur utilisation comme rappel après l'immunisation initiale par vaccination ou infection naturelle. Nous montrons ici que sCPD9 stimule efficacement les réponses immunitaires et améliore considérablement la protection lorsqu'il est appliqué trois semaines après la vaccination initiale. Il est important de noter que la sCPD9 améliore les réponses immunitaires humorales, en particulier contre les variantes d'échappement immunitaire connues telles que Beta et Omicron BA.1, tout en améliorant également le résultat virologique d'une infection de provocation hétérologue lorsqu'elle est appliquée en rappel trois semaines après la vaccination initiale. Cela indique une large portée pour l'utilisation des VLA dans les populations qui présentent un degré élevé d'immunité de base induite par une vaccination ou une infection antérieure.

En raison de son profil d'innocuité élevé, le sCPD9 a récemment été rétrogradé du niveau de biosécurité (BSL) 3 à BSL 2 par l'autorité publique allemande compétente52. Il s'agit d'une étape clé vers l'application clinique d'un LAV SARS-CoV-2 car il facilitera la production d'un vaccin de qualité clinique et facilitera considérablement les essais cliniques chez l'homme.

Des travaux in vitro et sur des animaux ont été menés dans des conditions de biosécurité appropriées dans une installation BSL-3 de l'Institut für Virologie, Freie Universität Berlin, Allemagne. Toutes les expérimentations animales ont été réalisées conformément aux directives institutionnelles, nationales et internationales pertinentes pour le soin et l'utilisation sans cruauté des animaux et approuvées par l'autorité compétente de l'État, Landesamt für Gesundheit und Soziales, Berlin, Allemagne (permis numéro 0086/20).

Des cellules Vero E6 (obtenues auprès de l'ATCC, CRL-1586), Vero E6-TMPRSS2 (obtenues auprès du National Institute for Biological Standards and Control (NIBSC), 100978) et Calu-3 (obtenues auprès de l'ATCC, HTB-55) ont été cultivées dans milieu essentiel minimal (MEM) contenant 10 % de sérum bovin fœtal, 100 UI ml-1 de pénicilline G et 100 µg ml-1 de streptomycine à 37 °C et 5 % de CO2. De plus, le milieu de culture cellulaire pour les cellules Vero E6-TMPRSS2 contenait 1 000 µg ml-1 de généticine (G418) pour assurer la sélection des cellules exprimant les gènes de résistance à la néomycine et TMPRSS2.

Le sCPD9 et les variantes B.1 du mutant SARS-CoV-2 vivant atténué modifié et du SARS-CoV-2 (BetaCoV/Munich/ChVir984/2020 ; B.1, EPI_ISL_406862), Beta (B.1.351 ; hCoV-19/Netherlands/ NoordHolland_20159/2021) et Delta (B.1.617.2 ; SARS-CoV-2, Humain, 2021, Allemagne ex Inde, 20A/452R (B.1.617)) ont été propagés sur des cellules Vero E6-TMPRSS2. Omicron BA.1 (B.1.1.529.1 ; hCoV-19/Allemagne/BE-ChVir26335/2021, EPI_ISL_7019047) a été propagé sur des cellules CaLu-3. Tous les stocks de virus ont été séquencés du génome entier avant les expériences d'infection pour confirmer l'intégrité génétique dans la majorité de la population, en particulier au site de clivage de la furine. Avant l'infection expérimentale, les stocks de virus ont été stockés à -80 ° C.

Des hamsters syriens âgés de 9 à 11 semaines (Mesocricetus auratus; race RjHan:AURA) ont été achetés chez Janvier Labs et ont été logés en groupes de 2 à 3 animaux dans des cages ventilées individuellement. Les hamsters avaient libre accès à la nourriture et à l'eau. Ils ont été autorisés à s'habituer aux conditions de logement pendant 7 jours avant la vaccination. Pour les deux expériences, les températures de la cage ont été maintenues dans une plage constante de 22 à 24 °C avec une humidité relative comprise entre 40 et 55 %.

Pour les expériences d'infection, des hamsters syriens ont été répartis au hasard en groupes, 50 à 60% des animaux de chaque groupe étant des femelles. Dans la première expérience, 15 hamsters ont été simulés ou vaccinés avec le virus sCPD9 vivant atténué, le pic Ad2 ou l'ARNm. La vaccination avec sCPD9 a été appliquée par instillation intranasale sous anesthésie (1 × 105 unités formant des foyers (ffu), 60 µl)53. Ad2-spike (5 × 108 unités infectieuses, 200 μl) et le vaccin à ARNm (5 μg d'ARNm, 100 μl) ont été appliqués par voie intramusculaire. Des hamsters vaccinés par simulation ont été vaccinés par instillation intranasale avec un surnageant de culture cellulaire stérile obtenu à partir de cellules Vero E6-TMPRSS2 non infectées. 21 jours après la vaccination, les hamsters ont été infectés par le variant SARS-CoV-2 Delta (1 × 105 unités formant plaque (pfu), 60 µl) par instillation intranasale sous anesthésie. Dans la deuxième expérience, 10 hamsters ont été soit simulés soit vaccinés avec l'un des trois vaccins (voir ci-dessus) suivi d'une vaccination de rappel 21 jours plus tard. 14 jours après la vaccination de rappel, les hamsters ont été provoqués comme décrit ci-dessus.

Pour déterminer la transmission ultérieure du virus d'épreuve chez les individus vaccinés, nous avons vacciné 3 animaux par groupe dans un schéma de rappel. À cette fin, les hamsters ont reçu soit 1 × 104 ffu sCPD9delFCS dans 60 µl de MEM par voie intranasale, 5 µg d'ARNm de BNT162b2 dans 100 µl de solution saline normale (0,9 % de NaCl dans de l'eau stérile) par voie intramusculaire ou 60 µl de MEM ordinaire par voie intranasale (simulacre). La vaccination a été renforcée en utilisant les mêmes vaccins pour chaque groupe respectif 21 jours après la vaccination initiale.

Les hamsters vaccinés ont été infectés avec 1 × 105 pfu SARS-CoV-2 variante B.1 comme décrit ci-dessus. Vingt-quatre heures après l'infection, des hamsters vaccinés infectés ont été mis en contact avec des animaux naïfs et cohabités pour surveiller la transmission pendant 6 jours consécutifs. Des écouvillons oraux quotidiens ont été obtenus de chaque animal pour surveiller l'excrétion et la transmission du virus.

sCPD9 a été cultivé sur des cellules Vero E6-TMRSS2 et titré sur des cellules Vero E6 comme décrit précédemment ; Les titres finaux ont été ajustés à 2 × 106 ufm ml-1 dans du MEM. Un pic Ad2 recombinant a été généré, produit sur des cellules 293T et purifié comme décrit précédemment23. BNT162b2 a été obtenu en tant que produit commercial (Comirnaty) et manipulé exactement comme recommandé par le fabricant, sauf que la concentration finale d'ARNm a été ajustée à 50 µg ml-1 (100 µg ml-1 est la concentration recommandée pour une utilisation chez l'homme) par ajouter une solution saline de qualité injectable (NaCl à 0,9 % dans de l'eau stérile) immédiatement avant utilisation.

Pour augmenter la stabilité génétique de la construction sCPD9, le site de clivage de la furine (FCS) de la protéine de pointe a été supprimé pour créer sCPD9delFCS. Ce virus vaccinal sans FCS n'a été utilisé que pour l'étude de transmission de cet article (Extended Data Fig. 5). Fait important, tous les vaccins utilisés dans cette étude contiennent le même antigène de pointe SARS-CoV-2 dérivé de la séquence ancestrale B.1 (Wuhan).

Le sCPD9 a été administré par voie intranasale sous anesthésie générale (0,15 mg kg-1 de médétomidine, 2,0 mg kg-1 de midazolam et 2,5 mg kg-1 de butorphanol) à une dose de 1 × 105 ffu par animal dans un volume total de 60 µl de MEM. Pour les expériences de transmission (Extended Data Fig. 5), 1 × 104 ffu sCPD9delFCS ont été appliqués de la même manière. Ad2-spike a été injecté par voie intramusculaire à 5 × 108 unités infectieuses dans 200 µl de tampon d'injection (3 mM KCl, 1 mM MgCl2, 10 % de glycérol dans du PBS). Le BNT162b2 a été injecté par voie intramusculaire à une dose de 5 µg d'ARNm par animal dans 100 µl de solution saline physiologique (0,9 % de NaCl dans de l'eau stérile).

Des lavages nasaux ont été obtenus de chaque hamster dans cette étude. A cette fin, le crâne de chaque animal a été fendu légèrement paramédian, de sorte que la cloison nasale est restée intacte d'un côté du nez. Par la suite, une pointe de pipette de 200 µl a été soigneusement glissée sous la cloison nasale et 150 µl de liquide de lavage (PBS avec 30 µg ml-1 d'ofloxacine et 10 µg ml-1 de voriconazole) ont été appliqués. Le lavage a été recueilli par la narine et la procédure de lavage a été répétée deux fois ; environ 100 µl d'échantillon ont été récupérés après le troisième lavage.

Les lavages nasaux obtenus à partir de l'essai de vaccination primaire uniquement ont été soumis à une analyse ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) des anticorps IgA spécifiques au pic SARS-CoV-2. Les lavages nasaux obtenus à partir de l'essai de vaccination prime-boost ont été utilisés pour le test de microneutralisation afin d'évaluer leur capacité à neutraliser la variante ancestrale B1 du SRAS-CoV-2.

Pour la quantification du virus compétent pour la réplication, 50 mg de tissu pulmonaire ont été utilisés. Des dilutions en série de 10 fois ont été préparées après homogénéisation des échantillons d'organes dans un broyeur à billes (Analytic Jena). Les dilutions ont été étalées sur des cellules Vero E6 cultivées dans des plaques à 24 puits et incubées pendant 2,5 h à 37 °C. Par la suite, les cellules ont été recouvertes de MEM contenant 1,5 % de carboxyméthylcellulose sodique (Sigma Aldrich) et fixées avec une solution de formaldéhyde à 4 % 72 h après l'infection. Pour compter les unités formant plaque, les plaques ont été colorées avec du bleu de méthylène à 0,75 %.

Les poumons ont été traités comme décrit précédemment53. Après élimination soigneuse du lobe pulmonaire gauche, le tissu a été fixé dans une solution de formaldéhyde à 4 % tamponnée au PBS (pH 7,0) pendant 48 h. Pour la préparation des conchae, des parties de la moitié gauche du crâne ont été fixées en conséquence. Ensuite, les poumons ou les conques ont été délicatement retirés de la cavité nasale et inclus dans de la paraffine, coupés à 2 µm d'épaisseur et colorés avec de l'hématoxyline et de l'éosine (H&E). L'hybridation in situ sur les poumons a été réalisée comme décrit précédemment54 en utilisant le kit ViewRNA ISH Tissue Assay (Invitrogen de Thermo Fisher) conformément aux instructions du fabricant, avec des ajustements mineurs. Pour la localisation de l'ARN du SARS-CoV-2, des sondes détectant les séquences du gène N (base de données NCBI NC_045512.2, nucléotides 28 274 à 29 533, ID de test : VPNKRHM) ont été utilisées. La liaison spécifique à la séquence a été contrôlée en utilisant une sonde pour la détection de la pneumolysine. L'immunohistochimie sur les conchae a été réalisée comme décrit précédemment55 (détails dans les méthodes supplémentaires).

Une analyse microscopique en aveugle a été effectuée par un pathologiste vétérinaire certifié (JB).

Un ELISA interne a été réalisé pour étudier les niveaux d'IgG spécifiques du SRAS dans le sérum et les niveaux d'IgA spécifiques du SRAS dans les lavages nasaux après la vaccination (détails dans les méthodes supplémentaires).

Pour évaluer la capacité des lavages nasaux obtenus à partir de l'essai de vaccination prime-boost à neutraliser le SRAS-CoV-2 authentique (B.1), les lavages nasaux ont été dilués 1: 1 dans 2 × MEM contenant 50 µg ml-1 d'enrofloxacine et 10 µg ml-1 de voriconazole. Des dilutions en série ultérieures ont été effectuées dans du MEM contenant 25 mg ml-1 d'enrofloxacine, 5 µg ml-1 de voriconazole et 1 % de FBS. Le SARS-CoV-2 (50 pfu) a été ajouté aux dilutions de lavage nasal et des dilutions de 1: 2 à 1: 256 ont été étalées sur des cellules Vero E6 presque confluentes ensemencées dans des plaques de culture cellulaire à 96 puits. A 3 jours après l'inoculation, les cellules ont été fixées et colorées au bleu de méthylène. Pour identifier les dilutions neutralisant le virus, l'intégrité de la monocouche cellulaire a été évaluée par comparaison avec des puits témoins qui ne contenaient ni lavage nasal ni virus. La dernière dilution sans preuve d'effet cytopathique induit par le virus a été considérée comme le titre neutralisant pour l'échantillon respectif.

Des échantillons de sérum ont été testés pour leur capacité à neutraliser différentes variantes du SRAS-CoV-2. Les échantillons du jour 0 de l'essai prime-boost n'ont pas pu être testés pour les anticorps neutralisants contre B.1.351 (bêta) en raison du manque de matériel. Les sérums ont été inactivés à 56 °C pendant 30 min. Des dilutions en série doubles (1: 8 à 1: 1 024) ont été étalées sur des plaques à 96 puits et 200 pfu SARS-CoV-2 ont été pipetés dans chaque puits. Après un temps d'incubation de 1 h à 37 °C, les dilutions ont été transférées dans des plaques 96 puits contenant des cellules Vero E6 sous-confluentes et incubées pendant 72 h à 37 °C (B.1, Beta, Delta) ou pendant 96 h à 37 °C (Omicron). Les plaques ont été fixées avec une solution de formaldéhyde à 4 % et colorées avec du bleu de méthylène à 0,75 %. Les puits qui n'ont montré aucun effet cytopathique ont été considérés comme neutralisés.

L'analyse ELISpot IFN-γ de hamster a été effectuée comme décrit précédemment56. En bref, le kit hamster IFN-γ ELISpotBASIC (MABTECH) a été utilisé pour détecter la sécrétion d'IFN-γ par 5 × 105 splénocytes isolés, chacun en co-culture avec différents stimuli. Les splénocytes traités au milieu ont servi de contrôle négatif et l'ovalbumine recombinante (10 mg ml-1) a été utilisée comme stimulus de contrôle protéique négatif. La stimulation générale des lymphocytes T a été obtenue en utilisant 5 μg ml-1 de concanavaline A (ConA, Sigma Aldrich). Protéine de pointe recombinante SARS-CoV-2 (2019-nCoV) (S1 + S2 ECD, étiquette His ; 10 mg ml-1 ; Sino Biological Europe) ou 10 mg ml-1 nucléocapside recombinante SARS-CoV-2 (2019-nCoV) protéine (N) (Sino Biological Europe) ont été utilisées pour re-stimuler les cellules T spécifiques du SRAS-CoV-2. Les spots ont été comptés à l'aide d'un scanner Eli.Scan ELISpot (AE.L.VIS) et du logiciel d'analyse ELI.Analyse v5.0 (AE.L.VIS).

Pour quantifier les copies génomiques dans des écouvillons oropharyngés et 25 mg de tissu pulmonaire homogénéisé, l'ARN a été extrait à l'aide du kit innuPREP Virus DNA/RNA (Analytic Jena) conformément aux instructions du fabricant. La qPCR a été réalisée à l'aide du kit NEB Luna Universal Probe One-Step RT – qPCR (New England Biolabs) avec des conditions de cycle de 10 min à 55 °C pour la transcription inverse, 3 min à 94 °C pour l'activation de l'enzyme et 40 cycles de 15 s à 94 °C et 30 s à 58 °C sur un cycleur qTower G3 (Analytic Jena) dans des plaques à 96 puits qPCR scellées. Des amorces et des sondes ont été utilisées comme indiqué précédemment57. Oligonucléotides (Séquence (5'-3')) : E_Sarbeco_F : ACAGGTACGTTAATAGTTAATAGCGT ;

E_Sarbeco_R : ATATTGCAGGAGCTACGCACACA ;

E_Sarbeco_P1 : FAM-ACACTAGCCATCCTTACTGCGCTTCG-BBQ.

Pour la quantification de l'expression génique, nous avons utilisé l'assemblage et l'annotation du génome MesAur 2.0 disponibles via la base de données du génome NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/11998?genome_assembly_id=1585474). Le fichier GFF a été converti en GTF à l'aide de gffread 0.12.758. Lorsqu'aucun chevauchement n'a été produit, les 3'-UTR dans l'annotation ont été étendus de 1 000 pb comme décrit précédemment59. D'autres étapes de polissage du fichier GTF sont décrites sur la page GitHub accompagnant cet article (https://github.com/Berlin-Hamster-Single-Cell-Consortium/Live-attenuated-vaccine-strategy-confers-superior-mucosal-and -immunité-systémique-au-SARS-CoV-2). Le fichier gtf final utilisé pour l'analyse est disponible via GEO (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE200596).

Pour effectuer le séquençage en masse de l'ARN, l'ARN a été isolé du tissu pulmonaire à l'aide du réactif Trizol conformément aux instructions du fabricant (Ambion, Life Technologies). En bref, 1 ml de Trizol a été ajouté à l'échantillon d'organe homogénéisé et soigneusement vortexé. Après un temps d'incubation de 20 min, 200 µl de chloroforme ont été ajoutés. Les échantillons ont été à nouveau vortexés et incubés pendant 10 min à température ambiante. Ensuite, les tubes ont été centrifugés à 12 000 × g pendant 15 min à 4 °C et 500 µl de la phase aqueuse ont été transférés dans un nouveau tube contenant 10 µg de GlycoBlue. De l'isopropanol (500 ul) a été ajouté, suivi d'un vortex, d'une incubation et d'une centrifugation des échantillons comme décrit ci-dessus. Ensuite, l'isopropanol a été éliminé et 1 ml d'éthanol (75 %) a été appliqué. Les tubes ont été retournés brièvement et centrifugés à 8 000 × g pendant 10 min. Après avoir libéré le culot de l'éthanol, l'ARN a été remis en suspension dans 30 µl d'eau sans RNase et stocké à -80 °C.

Les globules blancs ont été isolés du sang EDTA comme décrit précédemment; les étapes comprenaient la lyse des globules rouges et la filtration des cellules avant le comptage. Les cellules pulmonaires (lobe caudal) ont été isolées comme décrit précédemment26,60 ; les étapes comprenaient la digestion enzymatique, la dissociation mécanique et la filtration avant le comptage dans le bleu trypan. Les tampons contenaient 2 µg ml-1 d'actinomycine D pour empêcher la transcription de novo pendant les procédures.

Pour obtenir des suspensions unicellulaires de la muqueuse nasale de hamsters infectés par le SRAS-CoV-2, le crâne de chaque animal a été légèrement fendu paramédian afin que la cloison nasale reste intacte sur le côté gauche du nez. Le côté droit du nez a été soigneusement retiré du crâne et stocké dans du PBS 1 × glacé avec 1% de BSA et 2 µg ml-1 d'actinomycine D jusqu'à une utilisation ultérieure. Les parties du nez ont été transférées dans 5 ml de solution Corning Dispase additionnée de 750 U ml-1 Collagénase CLS II et 1 mg ml-1 DNase, et incubées à 37 ° C pendant 15 min. Pour la préparation des cellules de la muqueuse nasale, les conchae ont été soigneusement retirées de la cavité nasale et réincubées dans un milieu de digestion pendant 20 min à 37 ° C. Le tissu de Conchae a été dissocié par pipetage et pressage à travers un filtre de 70 µm avec un piston. Du PBS glacé avec 1% de BSA et 2 µg ml-1 d'actinomycine D a été ajouté pour arrêter la digestion enzymatique. La suspension cellulaire a été centrifugée à 400 × g à 4 ° C pendant 15 min et le surnageant a été jeté. Les cellules nasales en culot ont été remises en suspension dans 5 ml de tampon de lyse des globules rouges et incubées à température ambiante pendant 2 min. La réaction de lyse a été arrêtée avec du PBS 1 × avec 0, 04% de BSA et les cellules ont été centrifugées à 400 × g à 4 ° C pendant 10 min. Les cellules culottées ont été remises en suspension dans du PBS 1 × avec 0, 04% de BSA et filtrées à 40 µm. Les cellules vivantes ont été comptées dans du bleu trypan et les taux de viabilité ont été déterminés à l'aide d'une chambre de comptage. La concentration cellulaire pour scRNA-seq a été ajustée par dilution.

Des cellules isolées du sang, des poumons et des cavités nasales de hamsters syriens ont été soumises à un scRNA-seq à l'aide du système d'expression génique 10 × Genomics Chromium Single Cell 3' avec une technologie de codage à barres pour le multiplexage cellulaire (détails dans les méthodes supplémentaires).

Les lectures de séquençage ont été initialement traitées à l'aide de bcl2fastq 2.20.0 et de la commande multiple du logiciel Cell Ranger 6.0.2. Pour le démultiplexage du cellplex, les seuils d'attribution ont été partiellement ajustés (pour plus de détails, voir la page GitHub à l'adresse https://github.com/Berlin-Hamster-Single-Cell-Consortium/Live-attenuated-vaccine-strategy-confers-superior- immunité-muqueuse-et-systémique-au-SARS-CoV-2). Un traitement supplémentaire a été effectué dans R 4.0.4 Seurat R 4.0.6 package61, ainsi que dans les packages R ggplot2 3.3.5, dplyr 1.0.7, DESeq2 1.30.1, lme4 1.1–27.1 et dépendances, et dans Python 3.9.13 comme ainsi que les packages Python scanpy 1.9.1, scvelo 0.2.4 et dépendances. Dans l'étape suivante, les cellules ont été filtrées par un seuil de qualité lâche (minimum de 250 gènes détectés par cellule) et regroupées. Les types de cellules ont ensuite été annotés par grappe et filtrés à l'aide de seuils spécifiques au type de cellule (les cellules en dessous de la médiane ou dans le quartile le plus bas d'un type de cellule ont été supprimées). Les cellules restantes ont été traitées à l'aide du flux de travail SCT/integrate62 et les types de cellules ont de nouveau été annotés sur l'objet Seurat résultant. Tout le code pour l'analyse en aval est disponible sur GitHub à https://github.com/Berlin-Hamster-Single-Cell-Consortium/Live-attenuated-vaccine-strategy-confers-superior-mucosal-and-systemic-immunity-to- SRAS-CoV-2.

Les détails sur l'analyse statistique des données de séquençage, y compris les étapes de prétraitement, sont décrits dans la section Méthodes individuelles. Des analyses des statistiques virologiques, histopathologiques, ELISA, des fréquences cellulaires et du nombre de cellules ont été effectuées avec GraphPad Prism 9. Les détails statistiques sont fournis dans les légendes des figures respectives. Aucune méthode statistique n'a été utilisée pour prédéterminer la taille de l'échantillon. La distribution des données était supposée normale, mais cela n'a pas été formellement testé. Aucune donnée n'a été exclue des analyses. Toutes les expériences impliquant des animaux vivants ont été randomisées, les autres expériences n'ont pas été randomisées. Les enquêteurs ont été aveuglés à l'attribution des hamsters lors des expérimentations animales et de l'évaluation des résultats primaires (développement clinique, titrages de virus, qPCR, ELISpot, sérologie et histopathologie). Les enquêteurs n'ont pas été aveuglés à l'allocation dans d'autres expériences et analyses.

De plus amples informations sur la conception de la recherche sont disponibles dans le résumé des rapports sur le portefeuille Nature lié à cet article.

Les données de séquençage brutes sont disponibles sur GEO (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE200596), ainsi que les tables de comptage de lecture RNA-seq en masse, et les matrices h5 et Seurat objets pour les données scRNA-seq. Les données sources sont fournies avec ce document.

Le code est disponible sur GitHub à https://github.com/Berlin-Hamster-Single-Cell-Consortium/Live-attenuated-vaccine-strategy-confers-superior-mucosal-and-systemic-immunity-to-SARS-CoV- 2.

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Nous remercions VM Corman de Charité pour son aide dans la conception de l'étude et les discussions prolifiques sur les résultats et les conclusions ; S. Reiche (Friedrich-Loeffler-Institut, Greifswald, Allemagne) pour avoir fourni un anticorps de nucléocapside anti-SARS-CoV-2 ; C. Thöne-Reineke pour son soutien dans le domaine du bien-être et de l'élevage des animaux ; et l'European Virus Archive, D. Bourquain (Robert-Koch-Institut, Berlin, Allemagne) et C. Reusken (Institut national pour la santé publique et l'environnement, Bilthoven, Pays-Bas) pour avoir fourni les variantes du SRAS-CoV-2 utilisées dans cette étude . Les cellules Vero E6-TMPRSS2 ont été fournies par le NIBSC Research Reagent Repository, Royaume-Uni, avec nos remerciements à M. Takeda. Le financement a été assuré par : le programme de recherche et d'innovation Horizon 2020 de l'Union européenne - subvention EVA-GLOBAL 871029 ; Accord de la Deutsche Forschungsgemeinschaft OS 143/16-1 (NO); Subvention Deutsche Forschungsgemeinschaft SFB TR84, sous-projet Z01b (JT, ADG); Subvention Deutsche Forschungsgemeinschaft SFB TR84, sous-projets C06 et C09 (MW); Subvention Deutsche Forschungsgemeinschaft SFB 1449–431232613, sous-projet B02 (MW, GN); Bundesministerium für Bildung und Forschung - Subvention MAPVAP 16GW0247 (GN, MW); Bundesministerium für Bildung und Forschung - Subvention Organo-Strat 01KX2021 (ADG); Bundesministerium für Bildung und Forschung - subvention e:Med CAPSyS 01ZX1604B (MW); Bundesministerium für Bildung und Forschung - subvention e:Med SYMPATH 01ZX1906A (MW); Bourse Bundesministerium für Gesundheit – CHARIS 6a (MDM); Subvention 3R de la Fondation Einstein EZ-2020-597 FU (ADG); Fonds d'initiative et de mise en réseau de l'association Helmholtz - subvention COVIPA KA1-Co-02 (GTA, ML, EW); et une bourse Charité 3R (PP, CG). Les bailleurs de fonds n'ont joué aucun rôle dans la conception de l'étude, la collecte et l'analyse des données, la décision de publier ou la préparation du manuscrit.

Financement en libre accès fourni par la Freie Universität Berlin.

Ces auteurs ont contribué à parts égales : Géraldine Nouailles, Julia M. Adler.

Ces auteurs ont supervisé conjointement ce travail : Emanuel Wyler, Dusan Kunec, Jakob Trimpert.

Département des maladies infectieuses, de médecine respiratoire et de soins intensifs, Charité - Universitätsmedizin Berlin, membre corporatif de Freie Universität Berlin et Humboldt-Universität zu Berlin, Berlin, Allemagne

Géraldine Nouailles, Julia M. Adler, Peter Pennitz, Morris Baumgardt, Cengiz Goekeri & Martin Witzenrath

Institut de virologie, Université libre de Berlin, Berlin, Allemagne

Julia M. Adler, Christine Langner, Ricardo Martin Vidal, Na Xing, Azza Abdelgawad, Nikolaus Osterrieder, Dusan Kunec et Jakob Trimpert

Institut de pathologie Charité - Universitätsmedizin Berlin, membre corporatif de Freie Universität Berlin et Humboldt-Universität zu Berlin, et Institut de biologie, IRI Life Sciences, Humboldt-Universität zu Berlin, Berlin, Allemagne

Stefan Peidli & Nils Bluthgen

Institut de biologie des systèmes médicaux de Berlin (BIMSB), Centre Max Delbrück de médecine moléculaire de l'Association Helmholtz (MDC), Berlin, Allemagne

Luiz Gustavo Teixeira Alves & Emanuel Wyler

Institut de pathologie animale, Université libre de Berlin, Berlin, Allemagne

Judith Bushe, Anne Voss, Alina Langenhagen et Achim D. Gruber

Institut de virologie, Charité - Universitätsmedizin Berlin, membre corporatif de Freie Universität Berlin et Humboldt-Universität zu Berlin, Berlin, Allemagne

Fabian Pott, Julia Kazmierski, Daniela Niemeyer, Christian Drosten & Christine Goffinet

Institut de santé de Berlin (BIH), Berlin, Allemagne

Fabian Pott, Julia Kazmierski & Christine Goffinet

Essais de produits des MPIV, Division des médicaments vétérinaires, Paul-Ehrlich-Institut, Langen, Allemagne

Aileen Ebenig, Mona V. Lange & Michael D. Mühlebach

Centre allemand de recherche sur les infections (DZIF), site partenaire Gießen-Marburg-Langen, Giessen, Allemagne

Michael D. Mühlebach

Faculté de médecine, Université internationale de Chypre, Nicosie, Chypre

Gengis Goekeri

Institut de physiologie, Charité - Universitätsmedizin Berlin, membre corporatif de Freie Universität Berlin et Humboldt-Universität zu Berlin, Berlin, Allemagne

Szandor Simmons

Département de gynécologie, Charité - Universitätsmedizin Berlin, membre corporatif de Freie Universität Berlin et Humboldt-Universität zu Berlin, Berlin, Allemagne

Susanne Herwig & Gunter Cichon

Centre allemand de recherche sur les infections (DZIF), site partenaire Charité, Berlin, Allemagne

Daniela Niemeyer et Christian Drosten

Institut de biologie des systèmes médicaux de Berlin (BIMSB) Centre Max Delbrück de médecine moléculaire de l'Association Helmholtz (MDC) et Institut de biologie, Humboldt-Universität zu Berlin, Berlin, Allemagne

Marcus Landthaler

École des sciences de la vie, Université de Chongqing, Chongqing, Chine

Haibo Wu

Institut de santé de Berlin à la Charité, Universitätsmedizin Berlin, Berlin, Allemagne

Samantha D. Praktiknjo

Département des maladies infectieuses et de la santé publique, Jockey Club College of Veterinary Medicine and Life Sciences, City University of Hong Kong, Kowloon, Hong Kong, Chine

Nicolas Osterrieder

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DK et JT ont conceptualisé le projet. GN, JMA, PP, SP, GTA, MB, JB, AV, AL, FP, JK, C. Goekeri, DN, HW, SDP, EW, DK et JT ont développé la méthodologie. GN, JMA, PP, SP, GTA, JB, AV, AL, AE, MVL, MDM, SS, NX, CL, RMV, AA, SH, HW, ADG, SDP, EW, DK et JT ont mené les enquêtes. GN, JMA, PP, SP, GTA, JB, AV, AL, SDP, EW, DK et JT ont effectué la visualisation. GN, GC, ADG, C. Goffinet, MW, DN, CD et JT ont acquis des ressources. NO et JT ont acquis un financement. JT a administré le projet. GN, GC, CD, C. Goffinet, ML, NB, MW, ADG, SDP, NO, DK, EW et JT ont supervisé le projet. GN, JMA, EW, DK et JT ont rédigé le projet original. Tous les auteurs ont révisé et édité le manuscrit.

Correspondance avec Jakob Trimpert.

En lien avec ces travaux, la Freie Universität Berlin a déposé une demande de brevet (FU227EP - 22193939.0- 1111, Freie Universität Berlin, Allemagne) pour l'utilisation de sCPD9 comme vaccin chez l'homme. Dans cette demande, JT, NO et DK sont nommés comme inventeurs de sCPD9. La Freie Universität Berlin collabore avec RocketVax Inc. pour poursuivre le développement de sCPD9 et reçoit des fonds pour la recherche. Indépendamment de ce travail, GN a reçu un financement de projet de Biotest AG ; et MW ont reçu un financement pour la recherche de Bayer Health Care, Biotest, Pantherna et Vaxxilon, et pour des conférences et des conseils d'Alexion, Aptarion, Astra Zeneca, Bayer Health Care, Berlin Chemie, Biotest, Boehringer Ingelheim, Chiesi, Glaxo Smith Kline, Insmed, Novartis, Teva et Vaxxilon. Les autres auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

Nature Microbiology remercie Duane Wesemann et les autres examinateurs anonymes pour leur contribution à l'examen par les pairs de ce travail.

Note de l'éditeur Springer Nature reste neutre en ce qui concerne les revendications juridictionnelles dans les cartes publiées et les affiliations institutionnelles.

( a ) Le développement du poids corporel en pourcentage des hamsters vaccinés a été mesuré pendant 21 jours jusqu'au moment de la provocation virale et affiché en fonction du groupe de vaccination. Violine plot (tronqué) avec quartiles et médiane. (b) Expérience Prime-boost : expression relative des transcrits d'ARNm viraux couvrant la jonction canonique totale du SARS-CoV-2, par rapport aux transcrits génomiques totaux, générés après analyse de séquençage d'ARN en vrac à partir de tissu pulmonaire homogénéisé. Les valeurs sont indiquées dans l'échelle log10 pour les deux points de temps analysés. Nuage de points avec moyenne. ANOVA bidirectionnelle (analyse de variance) et test de comparaison multiple de Tukey. (c - j) Notation semi-quantitative des résultats histopathologiques des hamsters syriens inclus dans le réglage prime (c - f) et prime-boost (g - j): (c, g) La zone pulmonaire consolidée trouvée dans le lobe pulmonaire gauche est affichée en pourcentage. (d, h) Le score de bronchite tient compte de la sévérité de la nécrose épithéliale bronchique et de la bronchite. (e, i) Pour tenir compte de la réponse immunitaire cellulaire locale, l'infiltration pulmonaire des neutrophiles, des lymphocytes et des macrophages a été évaluée dans le score d'afflux de leucocytes. (f, j) L'étendue de l'endothélialite dans le lobe pulmonaire gauche est indiquée dans le score d'endothélialite. (c - j) Les résultats sont présentés sous forme de diagrammes au centre (médian), en boîte (25e au 75e centile) et en moustaches (Min à Max.). ANOVA bidirectionnelle et test de comparaison multiple de Tukey. ∗p < 0,05, ∗∗p < 0,01, ∗∗∗p < 0,001 et ∗∗∗∗p < 0,0001. (b - j) n = 5 hamsters individuels pour tous les groupes. Les expériences d'amorçage et d'amorçage ont été menées indépendamment.

Données source

Histopathologie représentative de sections pulmonaires colorées à l'hématoxyline et à l'éosine provenant d'expériences de vaccination d'amorçage uniquement et d'amorçage à 5 dpc. Les images sont représentatives de n = 5 hamsters par groupe indiqué. Les expériences d'amorçage et d'amorçage ont été réalisées indépendamment. Pour les deux expériences, les colonnes montrent, de gauche à droite, la bronchite, la pneumonie affectant les alvéoles respiratoires et les vaisseaux sanguins avec endothélialite. Dans l'approche prime-only, et contrairement à tous les autres groupes qui ont développé une bronchite nécrosuppérative et hyperplasique, seuls les hamsters vaccinés avec le sCPD9 présentaient une bronchite négligeable en présence d'une infiltration sous-épithéliale de type BALT avec des lymphocytes et des plasmocytes. Dans les poumons, les alvéoles des animaux vaccinés contre le sCPD9 présentaient un parenchyme respiratoire beaucoup moins consolidé, avec moins de macrophages et de neutrophiles infiltrants. Seuls les animaux vaccinés Ad2 et simulés ont développé un remodelage métaplasique alvéolaire marqué, indiquant une régénération après nécrose de l'épithélium alvéolaire. L'endothélialite était plus bénigne dans tous les groupes vaccinés par rapport aux animaux vaccinés par simulation. Dans les expériences de prime-boost, la bronchite hyperplasique était la plus légère chez les hamsters vaccinés avec sCPD9 + sCPD9 et ARNm + sCPD9. La consolidation du parenchyme respiratoire et l'alvéolite étaient les moins sévères dans les deux groupes ayant reçu le rappel de sCPD9. Le remodelage épithélial métaplasique était particulièrement prononcé chez les animaux vaccinés Ad2-Ad2. L'endothélialite a été fortement réduite à des degrés similaires dans tous les groupes de rappel. Barres d'échelle = 20 μm pour chaque colonne.

Données source

( a ) Projections bidimensionnelles de transcriptomes unicellulaires à l'aide d'UMAP de cellules sanguines provenant d'une expérience d'amorçage. Les cellules sont colorées par types de cellules annotées sur la base de gènes marqueurs connus. (b, d) Nombre de composants cellulaires par ml de sang pour l'expérience d'amorçage. ( c ) Pourcentage de composants cellulaires sanguins pour l'expérience d'amorçage. (b - d) L'ANOVA unidirectionnelle et le test de comparaisons multiples de Dunnett par rapport au groupe fictif par type de cellule sont présentés. Moyenne ± SEM, les symboles représentent un hamster individuel. nsCPD9 + sCPD9 = 3, nmRNA + sCPD9 = 3, nmRNA + mRNA = 3, nAd2 + Ad2 = 3, nmock + mock = 4 hamsters individuels comme symboles. ∗p < 0,05, ∗∗p < 0,01 et ∗∗∗p < 0,001.

Données source

( a ) Scores semi-quantitatifs des résultats histopathologiques chez les hamsters ayant reçu la primo-vaccination (rangée du haut) ou la primo-vaccination de rappel (rangée du bas). La zone affectée par les lésions muqueuses dues à l'infection par le SRAS-CoV-2 est indiquée en pourcentage. Le score de lésion tissulaire tient compte de l'exfoliation épithéliale, de la nécrose, de l'apoptose, des débris cellulaires et de la perte de cil. La présence de neutrophiles et de lymphocytes dans les conques nasales est évaluée par le score des cellules immunitaires. Centre (médian), Boîte (25e au 75e centile) et moustaches (Min à Max). L'ANOVA bidirectionnelle et le test de comparaison multiple de Tukey ont été effectués pour l'évaluation statistique. N = 5 hamsters individuels par groupe. ∗p < 0,05, ∗∗p < 0,01, ∗∗∗p < 0,001, ∗∗∗∗p < 0,0001. ( b ) Projections bidimensionnelles de transcriptomes unicellulaires à l'aide d'UMAP de cellules de tissus nasaux de l'expérience principale. La coloration indique les types de cellules annotés sur la base de gènes marqueurs connus.

Données source

(a) Conception d'une expérience de transmission ultérieure de preuve de principe. Les hamsters ont été vaccinés avec un LAV sCPD9 supprimé du site de clivage de la furine ou le vaccin à ARNm BNT162b2 selon un schéma de rappel. L'infection de provocation a été réalisée avec la variante B.1 du SRAS-CoV-2, les animaux vaccinés et provoqués ont cohabité avec des contacts naïfs commençant 24 heures après la provocation pendant 6 jours consécutifs. (b) Charge d'ARN du SRAS-CoV-2 dans les écouvillons oraux quotidiens prélevés sur des excréteurs vaccinés tout au long de la période de cohabitation. N = 3 par groupe, moyenne ± SEM. ANOVA bidirectionnelle, test de comparaisons multiples de Tukey. ( c ) charge d'ARN du SRAS-CoV-2 dans les poumons et ( d ) écouvillons pharyngés à la fin des animaux excréteurs vaccinés. N = 3, moyenne ± SEM, ANOVA unidirectionnelle, test de comparaisons multiples de Tukey. (e) Charge d'ARN du SRAS-CoV-2 dans les écouvillons oraux quotidiens prélevés sur des animaux de contact naïfs tout au long de la période de co-hébergement. N = 3, moyenne ± SEM. ANOVA bidirectionnelle, test de comparaisons multiples de Tukey. (f) Charge d'ARN du SRAS-CoV-2 dans les poumons et (G) écouvillons pharyngés à la fin des animaux de contact naïfs. N = 3, moyenne ± SEM, ANOVA unidirectionnelle, test de comparaisons multiples de Tukey. ∗p < 0,05, ∗∗p < 0,01, ∗∗∗p < 0,001, ∗∗∗∗p < 0,0001. Le panneau a a été créé avec BioRender.com.

Données source

Fig. supplémentaires. 1–13, Méthodes et références.

Données de base statistiques pour les chiffres supplémentaires.

Données sources statistiques.

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Réimpressions et autorisations

Nouailles, G., Adler, JM, Pennitz, P. et al. Le vaccin vivant atténué sCPD9 suscite une immunité muqueuse et systémique supérieure contre les variantes du SRAS-CoV-2 chez les hamsters. Nat Microbiol 8, 860–874 (2023). https://doi.org/10.1038/s41564-023-01352-8

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Reçu : 30 juin 2022

Accepté : 01 mars 2023

Publié: 03 avril 2023

Date d'émission : Mai 2023

DOI : https://doi.org/10.1038/s41564-023-01352-8

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